アクティベーション

Communications Biology volume 6、記事番号: 604 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

CAR T 細胞療法は、複数の適応症の標準治療となる可能性がある腫瘍治療の急速に成長している分野です。偶然にも、CRISPR/Cas 遺伝子編集技術は、より正確でより制御可能な細胞修飾方法論を期待して、次世代の CAR T 細胞製品の製造に参入しつつあります。これらの医学と分子の進歩が交差することにより、細胞治療の現在の限界を克服するのに役立つ、人工細胞を設計する全く新しい方法の機会が生まれます。この原稿では、設計されたフィードバックループの概念実証データを紹介します。私たちは、CRISPR を介した標的組み込みを利用して、活性化誘導性 CAR T 細胞を製造しました。この新しいタイプの操作された T 細胞は、その活性化状態に応じて CAR 遺伝子を発現します。この技術は、in vitro と in vivo の両方で CAR T 細胞の機能を調節する新たな可能性を開きます。私たちは、このような生理学的制御システムが、現在利用可能な次世代 CAR コンストラクトのツールボックスに強力に追加される可能性があると信じています。

修飾 T 細胞受容体 (TCR) またはキメラ抗原受容体 (CAR) を発現する遺伝子操作された T 細胞は、腫瘍悪性腫瘍を治療するための強力なツールです1。今日まで、血液疾患に対するいくつかの CAR T 細胞療法が承認されており、その他の多くの療法が臨床試験で評価されています 2。現在の市販製品はすべて、ウイルスベクターベースの遺伝子送達を使用しています3。これは確立された比較的安全な戦略ですが、いくつかの重大な制限があります。機構的には、現代のウイルスベクターは制御されていない半ランダムな組み込みに依存しています。ウイルスベクターの安全性は、CAR T 細胞製品で治療される患者数の増加によって証明されており、ウイルス遺伝子送達の安全性は保健機関によって受け入れられていますが、挿入変異誘発の固有のリスクは未解決の問題のままです 4,5,6。したがって、次世代 T 細胞製造では、CRISPR/Cas など、より適切に制御された遺伝子編集手法を使用することを目指しています。 CRISPR/Cas は、ゲノム内の事前定義された位置への標的遺伝子の正確な組み込みを可能にします7。これにより、編集手順がより正確になるだけでなく、遺伝子組み込み部位を利用する機会も開かれます。

現在まで、臨床で使用されているすべての CAR 遺伝子カセットは、強力で構成的に活性な人工プロモーターによって駆動され、活性化動態、表現型、および生存に直接影響を与える生理学的環境で起こる動的な転写制御を上書きします8。継続的な CAR 発現は、in vivo での枯渇や CAR 機能の最適化につながる可能性があります9。 CRISPR/Cas 技術により、内因性プロモーターの下流への遺伝子導入が可能になるため、人工プロモーターや外部プロモーターの必要性が減り、より生理的な細胞修飾に焦点が当てられます 8,10。ネイティブのプロモーター領域により、高度に制御された遺伝子転写が可能になります。複雑な配列パターンは、遠位エンハンサーとそれに関連する調節タンパク質からの制御信号を集めて、異なる転写を引き起こします 11。高度な生理学的遺伝子制御を保存することは、分化した細胞産物を操作するのに役立つ可能性があります。 CAR および操作された TCR をより適切にターゲティングすると、内因性 TCR プロモーターの制御下に人工遺伝子を挿入し、より生理的な (導入) 遺伝子発現を提供することにより、編集された T 細胞の効力と機能に明らかな利点がもたらされることが実証されています 12。

さらに、適切に設計された編集戦略は、CAR を介した殺害の精度を高めることができます。 CAR T 細胞は、標的抗原 (CD7、CD19、BCMA など) を発現する細胞の溶解において非常に強力ですが、健康な細胞と異常な細胞を区別しません 13、14、15。したがって、CAR T 細胞は、腫瘍除去という最初のタスクを実行した後、同族抗原を発現するすべての細胞を攻撃し続けます 16。 CAR T 細胞の存続によるこれらのオンターゲットオフ腫瘍副作用を回避するためのいくつかのアプローチが提案されています。たとえば、CAR T 細胞は、CAR T 細胞上で共発現される合成「キルスイッチ」に対する抗体を全身投与することにより、腫瘍を完全に除去した後に根絶でき、B 細胞の完全かつ持続的な回復につながります 17。別のオプションは、mRNA に基づいた CAR の一過性発現です。これは、mRNA が全身に供給されている限り、T 細胞を標的細胞に対して再指向します 18,19。ただし、このようなアプローチには、適用された分子の分布速度論、精度、浸透度、および持続性に対処するという課題があります。

健康な組織への損傷を軽減する別の方法は、論理的にゲートされた CAR T 細胞です20。たとえば、「AND」ゲート CAR T 細胞は、標的細胞上の二重抗原認識によってのみエフェクター機能を実行するため、腫瘍細胞と健康な組織をより正確に区別できます 21。ただし、健康な組織の破壊は、両方の抗原が二重認識を防ぐのに十分な空間的に分離されている場合にのみ確実に防止されます。さらに、「NOT」および「OR」ゲート制御 CAR も前臨床モデルで説明されています 22。これらの論理ゲートは、編集された T 細胞の機能を制御するための非常に魅力的で洗練されたアプローチであるように見えますが、複雑な細胞工学が必要であり、遺伝子ペイロードが大きい 23。

最近、CRISPR を介した IL-15 のノックインを IL-1324 の誘導性遺伝子座に誘導する、より洗練された方法が報告されました。著者らは、細胞刺激によるIL-15産生の有意ではあるが中程度の増加を観察し、その概念を検証するとともに、適切な遺伝子座選択の重要性を強調した。

この記事では、TCR/CAR遺伝子発現の制御を使用して、腫瘍除去後の持続的なオンターゲットオフ腫瘍組織破壊の問題を解決するための、ターゲットアプローチの拡張を提案します。私たちの戦略は、必要な遺伝子積荷を減らすことを目的としており、代わりに人工タンパク質の生理学的制御に依存しています。この目的を達成するために、我々は、生理学的シグナルカスケードを介して一時的かつ強力に発現される分子の遺伝子座に埋め込まれた構築物の使用を提案する。 T 細胞の場合、明らかな標的遺伝子座は、T 細胞の活性化時に同族タンパク質を上方制御するプロモーターの下流にあります (例: Nur77、FoxP3、CD69、PD-1、HLA-DR) 25,26。このアプローチにより、我々は、T 細胞刺激 (外因性または内因性) の持続が CAR/TCR 機能を発揮するための前提条件となる、時間的に調節されるシステムを作成しました。私たちはこれを操作されたフィードバックループと呼んでいます。細胞が活性化すると、標的構築物が発現します。この研究では、in vitro および in vivo の概念実証実験を通じて実現可能性を実証しました。当社は、当社が設計したフィードバックループが高度な細胞療法用途に利用できると確信しています。

我々は、理論的には、適切な遺伝子座を標的とし、相同組換えを介して挿入された場合、あらゆる構築物が内因性のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションと同様の方法で制御され得ることを概念化した。概念実証の例として、治療用 T 細胞工学に利用可能な適切な設定として抗 CD19 CAR T 細胞を選択しました (図 1a)。この場合、CAR構築物はT細胞活性化依存性プロモーターの下流領域に組み込まれ、同時に内因的にコードされたタンパク質のコード配列を破壊します。注目すべきことに、意図した評価のために、TCR/CD3複合体は編集されずに残されており、抗CD19抗原特異的活性化とは独立した古典的な抗CD3/CD28 T細胞（再）刺激が可能になっています。私たちの例では、最初にT細胞をポリクローナルに刺激し、次にCRISPR/Cas9システムで修飾します。これにより、CAR遺伝子が特定の遺伝子座に組み込まれ、下流配列がCARで置換されます（図1a）。私たちの編集戦略は、活性化の24〜48時間後に編集が行われる従来のCRIPSRプロトコルに従い、初期のポリクローナル刺激を必要とする最先端のCAR T細胞製造プロセス（例えば、超短時間プロセス）と一致しています。この最初の細胞活性化が維持される限り（特に抗原特異的設定において）、CARは発現され続け、正のフィードバックループを作り出します（CAR標的認識による活性化により、さらなるCARタンパク質産生が促進されます）（図1a）。この操作されたフィードバックループにより、細胞の活性化状態による CAR 発現の制御が可能になるはずです。

a 活性化依存性プロモーターの制御下でのCAR発現の概略図。 b PD1、CD25、CD69、TIGIT、および TIM3 活性化マーカーの生理学的発現動態。グラフは、少なくとも 3 人のドナーからのマーカー発現を経時的に示します。細胞は、d1後の最初の刺激後、d6(矢印)に再刺激された。接続線は平均を表します。 c CAR は PD1 遺伝子座に正常にノックインできます。代表的なドットプロットのセットとヒストグラムが表示されます。生きた単一の CD45+ 細胞について事前にゲートされたプロット。 d PD1 遺伝子座での CAR 発現は、ポリクローナル抗 CD3/CD28 刺激に応じて活性化に依存します。グラフは、3 つの独立した実験からの休息サンプルまたは再刺激サンプルにおける CAR 発現を任意単位 (AU) として表示します。 TRAC遺伝子座を標的としたCAR構築物およびレンチウイルス(LV)ランダム組み込みを介して発現したCAR構築物を対照として使用した。エラーバーは平均値 ± SD を表します。有意性は、対応のないスチューデントの t 検定を使用して分析されました。 e CAR T 細胞は、抗原特異的刺激によって増殖できます。グラフは、2 ラウンドの抗原特異的刺激時の拡大倍率を示しています。エラーバーは平均値 ± SD を表します。 f 抗原特異的増殖によりすべてのサンプルで CAR T 細胞含有量が増加しますが、ポリクローナル再刺激では活性化誘導性 CAR 発現設定でのみ CAR T 細胞含有量が増加します。グラフは、3 つの独立した実験から得られた、休止サンプルまたは再刺激サンプルにおける頻度として示されたマーカー発現を表示します。 PD1 遺伝子座を標的とした CAR 構築物およびレンチウイルス (LV) ランダム組み込みを介して発現された CAR 構築物が示されています。矢印は、刺激期間の開始 (d0) と終了 (d2) を示します。接続線は平均を表します。有意性は、対応のあるスチューデントの t 検定を使用して分析されました。

私たちの仮説を検証するために、T 細胞刺激によって上方制御されるいくつかのよく知られたマーカーを評価しました (図 1b)。選択基準として、発現動態、再刺激の可能性、および生物学的意義を評価しました。私たちは当初、2 つの古典的な T 細胞活性化マーカー (CD25 と CD69) に焦点を当てましたが、PD-1、TIGIT、および TIM3 マーカーの上方制御もテストしました。これらの後者の受容体は、T 細胞刺激によって上方制御されるだけでなく、その長期的な存在は T 細胞の枯渇と相関しています 26。最初の評価では、CD25 は休止期を通しても発現が上昇しているため、我々のアプローチには適さないことが判明しました (図 1b)。おそらく、TIGIT と TIM3 は、刺激後に発現が 50% 未満だったため、除外されました (図 1b)。最終的に、PD-1 の機能が最もよく特徴づけられており、PD-1 阻害はチェックポイント阻害剤治療で広く利用されている技術であるため、PD-1 を選択しました 27。理論的には、前述のように、PD-1 の破壊は CAR T 細胞に利益をもたらす可能性があります 28,29。したがって、最初の実験では、PD-1 遺伝子座への CAR ターゲティングに焦点を当て、操作されたフィードバックループ CAR 発現と PD-1 ノックアウト (KO) の潜在的な利点を組み合わせた 2-in-1 モデルを確立しました。。さらに、私たちの概念のより広範な適用を実証するために、CD69 遺伝子座のターゲティングもテストしました（補足図 1a-b）。私たちのモデルでは、可溶性抗CD3/CD28試薬（Expamers）で刺激したヒト初代T細胞を使用し、前述のように非ウイルスCRISPR/Cas9送達システムとdsDNA HDRテンプレートを使用しました8。編集されたT細胞はCAR構築物を容易に発現しましたが、PD-1の残留発現はほとんどなく、標的化された組み込みの成功と非常に効率的なPD-1 KOを示しました（図1c、補足図2）。次いで、これらの細胞を刺激しないままにして休止期に達するか、または追加用量のExpamersで再刺激しました。再刺激の 24 時間後、CAR 発現を評価しました (図 1d)。対照（TRAC遺伝子座へのCAR遺伝子ノックイン（KI）およびLV形質導入によってランダムに組み込まれたCAR）とは逆に、PD-1プロモーターの下流に位置するCARコンストラクトの発現は、再刺激後に有意に増加しました（図1d）。これは、操作されたフィードバックループ CAR 発現が我々のアプローチを通じて達成できるという最初の実験的検証でした。興味深いことに、CRISPR / Cas編集細胞におけるCAR発現は、LV媒介ランダムに組み込まれた受容体（図1d）とは対照的に、時間の経過とともに（そして活性化状態に関係なく）in vitroで自発的に増加するようであり（図1d）、これも安静時におけるPD-1の下方制御が不完全であることを示していますこの in vitro 環境では (図 1b)、CAR 操作 T 細胞の適合性が向上していることを示唆している可能性があります。

次に、2ラウンドの抗原特異的刺激の長期間にわたって誘導性CARコンセプトの堅牢性をテストすることにしました（図1e）。我々は、抗原特異的刺激により、使用される編集の種類に関係なく、サンプル内の抗 CD19 CAR T 細胞集団の相対頻度が増加すると予想しました。この目的のために、CD19 標的抗原を発現する B 細胞由来リンパ芽球様細胞株 (LCL) を使用して CAR T 細胞を増殖させました。 1 週間の共培養後、対象のすべてのサンプルで顕著な細胞増殖が実際に観察され、生産的な抗原特異的細胞応答が示されました。興味深いことに、細胞増殖の増加倍数は、LV対照と比較して、PD-1プロモーターによって制御されるCARを有するT細胞においてより高かった（図1e）。操作されたフィードバックループCAR T細胞の最初に報告された挙動の維持をさらに調査し、アッセイの細胞分解能を向上させるために、ポリクローナルおよび抗原特異的再刺激下でのLCL拡張細胞の応答を評価しました（図1f）。特に、CD25 および CD69 活性化マーカーの動的上方制御が、操作されたフィードバックループ CAR 発現の予想される動態と一致するかどうかを評価しました。予想通り、ポリクローナル再刺激後、CD25/CD69 および CAR 含量は両方とも再刺激後 2 日目に大幅に増加し、6 日目にはベースラインレベルに戻りました (図 1f、青線)。注目すべきことに、活性化誘導性CAR T細胞のグループにおいてのみ、CAR発現の一時的な上昇と相関する活性化マーカーの増加が見られる。これは、抗原特異的再刺激とは対照的であり、活性化の増強はより高いCAR含量に対応し、CAR組み込み戦略に関係なく、標的結合時のCAR+細胞の拡大を示し、それにより活性化マーカーは6日目まで上方制御され、その後9日目にベースラインに達し、標的細胞が完全に除去された後（図1f、赤線）。注目すべきことに、抗原特異的再刺激によるCAR+頻度の初期減少は、立体障害およびCARエピトープマスキングを引き起こすCAR+と標的細胞との間の初期相互作用に起因すると考えられる。これらのデータは、提案された設計されたフィードバックループが時間の経過とともに減少せず、編集されたセルの永続的な機能になることを確認しました。注目すべきことに、すべての研究中、定常状態のPD-1存在（（<20％）図1b）よりもCARのベースラインレベルの上昇（〜40％）（図1f）が観察されました。これは、編集戦略の結果、および一般的な T 細胞生物学に対する PD-1 KO の影響、または in vitro 培養のアーチファクトである可能性があります。

実際の実験で活性化誘導性 CAR 発現を検証した後、生成された CAR T 細胞の機能と追加レベルの制御の潜在的な利点をテストすることにしました。この目的を達成するために、我々は in vitro および in vivo 殺傷アッセイの両方を実行しました (図 2a、b)。 in vitro殺傷アッセイでは、細胞溶解能を測定するために、活性化（PD1 KO CAR KI +）または刺激を受けずに放置（PD1 KO CAR KI -）した、操作されたフィードバックループCAR T細胞を調製しました（図2a）。予想通り、刺激は、非刺激対照と比較した場合のCD19 + HEK標的細胞のより速いクリアランスとして測定されるCAR T細胞の殺傷機能を増強した。重要なのは、この結果は、活性化状態の低下、つまり効力の低下と解釈できることです。どちらの観察も、抗原媒介機能は細胞活性化状態によって調節できるという概念と一致しています。その後、異種移植Rajiマウスモデルにおける細胞殺傷効果を評価しました（図2b）。提示されているように、産生された CAR T 細胞は、CAR 組み込み戦略に関係なく、同等の方法で数週間以内に腫瘍細胞を効果的に除去しました。注目すべきことに、CD69プロモーター下でCARを発現するT細胞も、PD-1下ほど強力ではないものの、腫瘍制御を示しました（補足図1c〜e）。これらのデータは、PD1 KO CAR KI の能力だけでなく、CRISPR 媒介遺伝子工学の一般的なアプローチの能力も示しています。

a 活性化された操作されたフィードバックループ CAR T 細胞は、休止した対応物と比較して、より速い in vitro 死滅を示します。グラフは、標的細胞の抗原特異的死滅の読み取り値としてのインピーダンス測定を示しています。非形質導入 T 細胞 (陰性コントロール)、PD1 KO のみ T 細胞 (PD1 KO)、LV 形質導入 (LV コントロール)、休止 (PD1 KO/CAR KI -) およびポリクローナル再刺激された CAR T 細胞 (PD1 KO/CAR KI +) ）改変されたフィードバックループCAR T細胞を使用した。実験では、4 つの重複の中央値から導出された単一のデータポイントが示されています。 b 操作されたフィードバックループ CAR T 細胞は、in vivo マウスモデルにおいて最先端の CAR T 細胞製品と同様に機能します。腫瘍はIVIS生物発光測定を使用して検出されました。 1 つの代表的な実験からの発光画像が示されています。矢印はマウスの再チャレンジを示します。 c 操作されたフィードバックループ CAR T 細胞は、腫瘍を完全に根絶した後に B 細胞コンパートメントを回復するのに役立ちます。個々のマウスの血液中のCAR T細胞含有量は、フローサイトメトリーで測定された細胞頻度を使用して計算されました。細胞は生きたリンパ球に対して事前にゲートされていました。ボックスは、B 細胞の再チャレンジ (d35) 後の細胞頻度を強調表示します。 b および c の星印で強調表示されている、腫瘍負荷が長期化したマウス。各行は対応するマウスを表します。 d 35日目のB細胞の再チャレンジにより、LV形質導入CAR T細胞含有量が急速に増加しますが、操作されたフィードバックループCAR T細胞含有量は変化しません。デルタは、28日目（腫瘍除去）と45日目（再チャレンジ後）の間のCAR T細胞頻度に基づいて計算されました。

活性化状態が集団レベルでのCAR T細胞の効力に変換される可能性があるというインビトロでの観察に基づいて、我々は同様の効果をインビボで再現することを期待した。我々は、腫瘍除去の数週間後にマウスを再攻撃すると、常にCARを発現する対応物と比較した場合、活性化誘導性CAR T細胞の応答が少なくとも遅れるはずであると仮説を立てた（図2c、d）。この目的を達成するために、CAR T 細胞と同じドナーに由来する初代 B 細胞を注射し、CAR による腫瘍寛解後に健康な B 細胞が患者の血流に復帰するシナリオを模倣しました。マウスモデルの限界により、どの時点でもB細胞を直接検出することはできませんでしたが、試験したCAR T細胞集団には経時的に有意な差が観察されました。まず、最初の注射から5週間後、および腫瘍除去から3〜4週間後でも、ランダムな組み込みによって生成されたCAR+細胞のかなり一定の高頻度が観察されました（図2c）。対照的に、操作されたフィードバックループ CAR T 細胞の含有量は 2 週間後に劇的に減少し、これは腫瘍の欠如と一致しました。 1 匹の外れ値の動物のみで、CAR T 細胞の維持と腫瘍の存続の両方が比例して延長されました (図 2b、c)。興味深いことに、B細胞の再チャレンジ(d35)では、活性化誘導性CAR T細胞とは逆に、従来のCAR T細胞の有意な増加が観察され、構成的CAR発現を持つ細胞のより迅速な抗原特異的応答が示唆されました(図2d)。観察された反応は、定常状態における以前の細胞の含有量がはるかに高いためである可能性が最も高くなります。この発見は、循環中に CAR T 細胞が変化せずに継続的に存在すると、B 細胞の自然な回復が阻害されるという我々の仮説と一致しています。残念ながら、動物がGvHDの症状を示し始めたため、使用したマウスモデルの異種移植の性質により屠殺する必要があったため、私たちの研究は7週間を超えて延長することができませんでした。

結論として、我々は、in vitro および in vivo の概念実証実験を通じて、活性化誘導性の内因性プロモーター下での CAR 発現により、制御された機能的な CAR T 細胞が得られることを実証しました。

この原稿では、操作されたフィードバックループの形で内因性遺伝子制御を介して、外因性構築物の発現を制御し、編集された細胞の機能を獲得するアプローチを紹介します。この設定では、目的の構築物をコードする人工遺伝子が、プロモーターによって管理されるゲノムの位置に導入され、その活性は細胞の活性化状態に依存します。概念実証実験では、臨床的に関連するシナリオに焦点を当て、T 細胞修飾に CAR コンストラクトを利用しました。私たちは、CD25、CD69、TIM3、TIGIT、PD-1 など、いくつかの大幅に上方制御された古典的な活性化依存性 T 細胞マーカーを使用して仮説を検証しました。この場合、CAR構築物を同時発現させるか（例：CD69）、または標的遺伝子（例：PD-1）を破壊することで、理論的には何がより望ましいかに応じて抗腫瘍効力を向上させることができます。人工遺伝子の生理学的発現のための別の工学的アプローチは、DNAM-1 などの疲労時に下方制御される受容体の下流への組み込みである可能性があります。この戦略は、終末期 T 細胞の枯渇を防ぎ、機能的な T 細胞の持続性を高める可能性があります 30,31。提示されたデータでは、PD-1 遺伝子と CD69 遺伝子を標的として破壊しました。しかし、我々は、以前に報告されたPD-1破壊の利点を十分に拡張することを評価しませんでした。

この活性化誘導性システムでは、CAR 含有量が細胞の活性化状態によって集団レベルで調節できることを実証できました。さらに、この制御は、標的タンパク質の生理学的発現パターンおよび間接的（非CAR媒介）刺激時のアップレギュレーション動態に従います。我々は、このパターンが少なくとも 3 ラウンドの刺激の間維持できることを実証しました。生理学的状態からの相違が検出された唯一の点は、刺激されていない状態の CAR 陽性 T 細胞の頻度がはるかに高かったことです。この予想より高い基礎発現は、非クラスター化 CAR が選択されたにもかかわらず、CAR を介した持続性シグナル伝達によって説明される可能性があります。リガンド非依存性の CAR オリゴマー化が T 細胞を疲弊させる可能性があることは以前に記載されています 32。あるいは、定常状態での発現レベルの上昇は、インビトロ培養および培養誘導性の非特異的活性化のアーチファクトとして解釈することもできます。興味深いことに、in vivo マウスモデルでは、CAR 陽性 T 細胞の頻度は、腫瘍の根絶と予想される PD-1 の生理学的下方制御と並行して低下したため、標的活性化マーカーの自然な発現動態によりよく似ていました。

CAR含有量の制御は、インビトロとインビボの両方でT細胞集団の機能の異なる性質に変換されました。インビトロ死滅アッセイでは、再刺激された細胞は、休止した細胞よりも実質的に速く抗原発現細胞を除去した。その可能性を正式に排除することはできませんが、条件間の時間が短いため、これが再刺激による表現型の変化の結果であるとは予想しません。興味深いことに、Raji マウスモデルでは、腫瘍除去中の T 細胞活性と血液中に検出される CAR 陽性 T 細胞の割合との間に顕著な相関関係が観察されました。この相関関係は、悪性細胞の持続期間が長いマウスでは長期間にわたって高い CAR T 細胞レベルを示す単一動物レベルでも見られました。しかし、PD1 KO CAR KI細胞を投与されたすべてのマウスでは、レンチウイルス形質導入によって生成されたCAR T細胞を投与された対照動物とは対照的に、腫瘍除去後にCAR頻度が大幅に減少した。その結果、B 細胞を注射すると、CAR 含有量の顕著なスパイクによって測定されるように、レンチウイルスコントロールマウスははるかに速く反応しました。それにもかかわらず、私たちの測定は血液中のCAR T細胞の頻度に焦点を当てており、これらの細胞の他の体のニッチへの移動を排除することはできないと述べておく必要があります。

これらの結果は、CAR T 細胞療法の一時的安全機構として、操作されたフィードバックループの潜在的な応用を示唆しています。構築物のノックインが内在性 TCR の同時破壊と組み合わされる場合、T 細胞活性化 (製造中の初期刺激によって誘導される) は CAR 機能によってのみ維持され、in vivo ですべての標的細胞が枯渇すると停止します。言い換えれば、CAR T細胞は、標的細胞（例：CD19発現腫瘍細胞）を見つける限り、活性を維持し、その機能を実行します。すべての標的細胞を除去すると、T 細胞の活性化と生物学的に関連する CAR の発現が低下します。これにより、最終的に CAR T 細胞が無反応になり、同じ標的抗原を提示する健康な細胞集団 (例: 健康な B 細胞または T 細胞区画) が回復できるようになります。さらに、内因性 TCR が不足すると細胞の再活性化が妨げられます。無反応のCAR-TCRダブルネガティブT細胞は患者の回復に影響を与えるべきではなく、持続性シグナル伝達を受信できないために死滅する可能性があります。ただし、この仮説を完全に検証するには、慢性再刺激アッセイなどのさらなる研究を行う必要があります。

これは、T 細胞表面での CAR の継続的発現を促進する古典的な LV 媒介ランダム組み込みとは対照的です。このような CAR T 細胞は、潜在的な再発に対してより迅速に反応し、腫瘍の再発をよりよく制御する可能性が最も高くなります。したがって、我々は従来の方法で編集されたCAR T細胞の可能性には異議を唱えず、むしろ、標的の適応症に応じて調整できる新しい編集メカニズムを提供します。さらに、我々は、容易に入手可能なCAR構築物(抗CD19)についてのみ我々のコンセプトをテストした。抗原密度の低い標的 (HER2 や GPC2 など) や、より強力な内因性プロモーターや高親和性 CAR を使用してこの低い抗原密度を相殺する必要があるかどうかなど、さまざまな状況で CAR デザインをテストすることは依然として興味深いでしょう。デザイン。

我々は、提案された編集ロジックは、オンターゲットのオフ腫瘍死滅により一時的に限定された細胞療法が望ましいものとなる他の臨床的に関連するシナリオでも活用できると考えています。提示された操作されたフィードバックループは、T 細胞療法をさらに改良するための最先端の遺伝子送達方法を組み合わせた強力なツールです。私たちの研究がCAR T細胞の分野でさらなる発展を促すことを願っています。

PBMC は、Biocoll (Biochrom) を使用した密度勾配遠心分離によって新鮮な軟膜から単離されるか、社内の T 細胞選択技術 ATC を使用して白血球除去材料から選択されました。バフィーコートは、ミュンヘンドイツ心臓センター麻酔科研究所（バイエルン州およびミュンヘン工科大学）の自家成人女性または男性の献血者から入手した。各ドナーから書面によるインフォームドコンセントが得られ、血液サンプルの使用は地元の治験審査委員会による国内法およびヘルシンキおよびイスタンブールの宣言に従って承認されました（ミュンヘン工科大学医学部倫理委員会：360/13および55） /14)。健康なドナーから受け取った白血球除去サンプルは、倫理的引用 (ドレスデン工科大学の倫理委員会: EK309072016) に基づいて、CCC Cellex Collection Center Dresden で収集されました。

一般に、T 細胞は社内の T 細胞選択技術を使用して濃縮されました 33。単離したT細胞を、サイトカインの存在下または非存在下で無血清培地(Thermo Fisher)中で培養した。濃縮された T 細胞は、以前に記載されているように、特定の時点で Expamers で刺激されました 30。

gRNA の crRNA 配列は、PDCD1 (PDCD1 を標的とする) の場合は 5-CGTCTGGGCGGTGCTACAACGTTT-TAGAGCTATGCT-3、TRAC の場合は 5-AGAGTCTCTCAGCTGGTACAGTTTTAGAGCTATGCT-3 でした。 RNP は製造業者の推奨に従って調製されました。簡単に説明すると、80 μM tracrRNA (IDT DNA) および 80 μM crRNA (IDT DNA) を 95 °C で 5 分間インキュベートし、その後 RT まで冷却しました。 24 μM の高忠実度 Cas9 (IDT DNA) を gRNA 溶液にゆっくりと添加して、12 μM Cas9 および 20 μM gRNA、および 20 μM エレクトロポレーションエンハンサー (IDT DNA) を含む RNP を生成しました。 RNP を室温で 15 分間インキュベートし、エレクトロポレーションに直接使用しました。

二本鎖 DNA PCR 産物はエレクトロポレーションと HDR (相同性指向修復) に使用されました。プラスミドDNAは、以下の製造業者のプロトコールに従ってPCRにより増幅した。熱サイクルは次のように実行しました: 初期変性として 95 °C および 30 秒、続いて最終変性として 95 °C 30 秒、62 °C 30 秒、72 °C 3 分間および 72 °C 4 分間を 34 サイクルしました。延長ステップ。最終ＰＣＲ産物は、製造業者（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）のプロトコールに従ってＡｍｐｕｒｅＸＰビーズにより精製した。すべての HDR テンプレートは滴定されました。一般に、1 × 106 細胞あたり 1 μg DNA のエレクトロポレーションでは、最高のノックイン効率が得られました。

精製したT細胞をExpamersおよび300 IU ml-1の組換えヒトIL-2、5ng ml-1の組換えヒトIL-7(Peprotech)および5ng ml-1のIL-15で48時間活性化した。エクスパマー刺激は、1 mM D-ビオチン (Sigma) とのインキュベーションによって破壊されました。 4D Nucleofector Xユニット（Lonza）を使用して、20μl Nucleofector Solution P3（Lonza）中のCas9リボ核タンパク質およびDNAテンプレートを用いて、1×106細胞をエレクトロポレーション（パルスコードEH100）しました。エレクトロポレーション後、編集後5日目の最初の分析まで、細胞を180 IU ml-1 IL-2を含む無血清培地中で培養した。 KI効率は、導入されたscFvに対して特異的な抗CAR抗体(Juno Therapeutics)を使用して測定した。 KOは、PD1(BioLegend)の表面発現を染色することによって測定した。

ゲノムDNAを、トランスジェニックおよび統合された受容体を発現する修飾細胞から抽出した(PureLink Genomic DNA Mini Kit、Invitrogen)。 PCRを5'相同性アームから3'相同性アームまで実行して、完全な構築物の組み込みを確認した。 5' ゲノム DNA の外側から組み込まれた DNA 配列へ DNA 配列を増幅する PCR により、目的の遺伝子座への挿入が検証されました。精製された PCR 産物は、続いてサンガー配列決定されました (Eurofins)。

インビトロ増殖では、編集された T 細胞を EBV 形質転換 B 細胞 (LCL) と 1:7 (E:T) の比率でインキュベートし、記載されたプロトコールをそれに応じて実行しました 33,34。 CAR の頻度と絶対数を監視し、指定された増殖時点にわたって測定しました。

増殖させて休息させた改変CAR T細胞を用いて、連続刺激実験を実施した。 Expamers 刺激は前述のように実行されました。刺激シグナルは、1 mM ビオチンを添加することによって破壊されました。続いて細胞を洗浄し、低用量のIL-2（25 IU ml-1）を含む新鮮な培地に移した。活性化マーカーの表面発現をフローサイトメトリー（以下を参照）によってモニターし、細胞数を測定した（Nucleocounter、Chemotec）。

in vitro 殺傷アッセイには、xCELLigence RTCA System (ACEA Biosciences Inc.) を使用しました。 CD19 を発現するヒト胎児腎臓細胞 (HEK293-CD19+) を標的として、特異的溶解を測定しました。 2 × 104 個の標的細胞を 96 ウェル E プレート (ACEA Biosciences Inc.) に播種し、一晩静置しました。改変された CAR T 細胞を 5:1 (E:T) の比率で添加し、指定された時間インキュベートしました。インピーダンス信号の変化をリアルタイムで測定し、RTCA Software Pro (ACEA Biosciences Inc.) を使用して分析しました。使用した細胞株はすべて未修飾であり、ATCC から購入しました。

フローサイトメトリーは前述のように実行されました 33。以下の抗体を BioLegend より購入し、解析に使用しました。 CD3 (クローン OKT3-PC7)、CD4 (クローン OKT4-BV421)、CD8 (クローン RPA-T8-BV510)、CD45 (クローン HI30)、PD1 (クローン EH12.2H7-FITC および -BV421)、CD69 (クローン FN50-) APC/Fire）、CD19（クローン HIB19-BV421 および -FITC）、CD25（クローン BC96-BV605）。さらに、APC (Bristol Myers Squibb) およびヨウ化プロピジウム (Thermo Fisher Scientific) と結合した自社製の抗イディオタイプ (CD19) 抗体を使用しました。すべての抗体の希釈は、製造元の推奨に従って行われました。

NSG-SGM3 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmWjlTg (CMV-IL3、CSF2、KITLG) 1Eav/MloySzJ、NSGS、The Jackson Laboratory) マウスは、Jackson Laboratory (The Jackson Laboratory) から購入し、病原体のない施設で社内で飼育しました。標準手順に従ってミュンヘン工科大学で。実験には6〜10週齢のマウス（雄および雌）を使用しました。すべての実験は、前述のように、オーバーバイエルン王国のガイドラインに従って実施されました。すべてのプロトコールは、Regierung von Oberbayern の施設内動物管理使用委員会 (ROB-55.2-2532.Vet_02-17-138 および Vet_02-18-162) によって承認されました。

B 細胞の再チャレンジは、腫瘍除去の 2 週間後に 10 × 106 個のドナー一致 B 細胞を注射することによって実行されました。動物実験は、動物実験に関連するすべての倫理規定に従って実施されました。

フローサイトメトリーデータは、FlowJo ソフトウェア (FlowJo, LLC) を使用して分析しました。グラフおよび統計分析は、GraphPad Prism ソフトウェア (GraphPad ソフトウェア) を使用して生成されました。

すべての実験では、反復回数が技術的に難しい場合（マウス研究など）を除き、サンプルサイズは標準的な実験実践（主に3回以上の独立した実験）に基づいて選択されました。統計的有意性は、対応のないスチューデントの t 検定を使用して分析されました。統計的なサンプルサイズの計算は実行されませんでした。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

著者らは、この研究のために生成または分析されたデータが論文およびその補足情報内で入手可能であることを宣言します。グラフの背後にあるソースデータは補足データ 1 で入手できます。記載されている調査結果はブリストルマイヤーズスクイブ社の専有物であり、一部の情報は企業秘密とみなされます。この研究の結果を裏付ける生データは著者から入手可能ですが、これらのデータの入手には制限が適用される場合があります。ただし、データは、合理的な要求があり、ブリストルマイヤーズスクイブ社の許可を得た場合に著者から入手できます。

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Michaela Wagner 氏、Eileen Benke 氏、Katrin Manske 博士の卓越した技術サポートに感謝いたします。

Simon P. Fraessle、Claudia Tschulik、Manuel Effenberger の著者も同様に貢献しました。

Juno Therapeutics GmbH、ブリストル・マイヤーズスクイブ社、グリルパルツァー通り。 10、81675、ミュンヘン、ドイツ

サイモン P. フレースル、クラウディアチュリク、マヌエルエフェンベルガー、ヴラドクレティウ、マリアゲルゲット、ロータージェルメロス、クリスチャンステンベルガー & マテウシュ P. ポルトラック

ミュンヘン工科大学医療微生物学研究所免疫学および衛生学、ミュンヘン、ドイツ

キリアン・ショーバー & ダーク・H・ブッシュ

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SPF、CT、ME、VC、MG は研究デザインに貢献し、実験を実施し、データを分析しました。 KS と DHB は遺伝子工学プロトコルを開発し、提供しました。 CS、LG、MPP がプロジェクトを設計し、監督しました。 SPF、ME、MPP が原稿を編集しました。著者全員がこの原稿をレビューしました。

マヌエル・エフェンベルガーへの通信。

SPF、CT、ME、VC、MG、DHB、CS、LG、および MPP は現在、ブリストル・マイヤーズスクイブ社の Juno Therapeutics GmbH およびブリストル・マイヤーズスクイブ社の自社株式に採用されています。 LG、CS、および MPP は、以前に提出された関連特許出願の発明者として記載されています。他のすべての著者は、競合する利益を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Mo Li と Christina Karlsson Rosenthal。査読ファイルが利用可能です。

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転載と許可

Fraessle、SP、Tschulik、C.、Effenberger、M. 他。活性化誘導性 CAR 発現により、操作された CAR T 細胞の機能を正確に制御できます。 Commun Biol 6、604 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04978-w

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受信日: 2022 年 11 月 15 日

受理日: 2023 年 5 月 25 日

公開日: 2023 年 6 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04978-w

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